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雙螢光素酶報告基因檢測技術服務

 

螢光素酶報告基因系統廣泛應用于真核生物基因表達和細胞生理學研究,包括受體活性、轉錄因子、細胞信號轉導、mRNA加工和蛋白質折疊等。螢光素酶是理想的報告基因,因為哺乳動物細胞中不含內源性螢光素酶,一旦轉錄完成立刻就生成功能性的螢光素酶。單螢光素酶報告基因實驗往往會受到各種實驗條件的影響,而雙螢光素酶報告基因通常被用來提高實驗精確度,即在一個系統中同時表達和測量兩個獨立的報告基因。一般來說,實驗組報告基因與具體實驗條件的影響是相關的,而共同轉染的內對照組報告基因則是用來充當校正參數,作為內參提供反應基線。將實驗組的結果與內對照組的結果進行約化處理,可降低由細胞存活率或轉染效率的差異而導致的結果波動,同時還可消除由取樣體積、細胞裂解效率和儀器測定引起的實驗誤差。因此,雙報告基因檢測可以通過減少外部影響來獲得更可靠的實驗數據。

美侖雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(Meilunbio®Firefly&Renilla Luciferase Reporter Assay Kit)提供了一種有效的雙報告基因檢測方法,在同一個樣品中先以螢光素(Luciferin)為底物來檢測螢火蟲螢光素酶(Firefly luciferase),后以腔腸素(Coelenterazine)為底物來檢測海腎螢光素酶(Renilla luciferase),同時淬滅Firefly luciferase的螢光信號,實現雙螢光素酶報告基因檢測。

 

本公司現提供雙螢光素酶報告基因檢測技術服務具體內容如下:

 

 

 

 

一. 啟動子活性研究

順式作用元件(cis-acting element)存在于基因旁側序列中能影響基因表達的序列。順式作用元件包括啟動子、增強子、調控序列和可誘導元件等,它們的作用是參與基因表達的調控。而轉錄因子則是一種具有特殊結構、行使調控基因表達功能的蛋白質分子,也稱為反式作用因子。

檢測藥物或者轉錄因子對于靶基因啟動子調控作用是雙酶報告基因主要功能之一。將目的基因啟動子區連接到Firefly luciferase序列,通過給藥或者共表達轉錄因子后,報告基因表達的改變,來確定給藥或者轉錄因子對靶基因啟動子調控作用。

 

1. 檢測藥物處理對目的啟動子活性的影響

材料:實驗質粒pGL4.17[luc2/Neo] (E6721 Promega);對照質粒;pGL4.73[hRluc/SV40] (E6911 Promega);目的藥物;目的細胞株

步驟:

1)藥物選擇、作用啟動子以及目的細胞株都確認后,合成啟動子序列;

2) 將啟動子克隆至報告基因載體;

3) 將報告載體與內參質粒共轉染293T細胞;

4) 多功能酶標儀檢測報告基因表達水平

5) 數據分析,整理提交客戶原始數據及實驗報告

注:為了實驗嚴謹性,根據實驗需要可以添加突變組或者天然組作為對照

分組參考:一組實驗包括(啟動子;空載;啟動子+給藥;空載+給藥),每組檢測時各做3個復孔。給藥梯度如果是5個濃度,那么一按照1000元/濃度加價。

 

客戶需提供信息:

①目標啟動子信息(名稱、種屬、基因序列等)

②所需藥物名稱及濃度梯度設計

提供給客戶:

①質粒及其構建報告

②原始數據

③雙熒光素酶檢測報告

報價情況

美侖生物 7000/組+1000元/單個藥物濃度;

服務周期3-5周

2.檢測轉錄因子對目的啟動子活性的影響

材料:實驗質粒pGL4.17[luc2/Neo] (E6721 Promega);對照質粒;pGL4.73[hRluc/SV40] (E6911 Promega);轉錄因子過表達質粒;293T細胞株

步驟:

1) 靶點預測及確認后,直接合成啟動子序列或者轉錄因子調控區序列;

2) 將上述合成的DNA片段克隆至報告基因載體;

3) 構建轉錄因子過表達載體;

4) 將報告載體和內參質粒以及轉錄因子過表達載體共轉染293T細胞;

5) 多功能酶標儀檢測報告基因表達水平

6) 數據分析,整理提交客戶原始數據及實驗報告

注:為了實驗嚴謹性,根據實驗需要可以添加突變組或者天然組作為對照。

分組參考:一組實驗包括(啟動子;空載;啟動子+轉錄因子;空載+轉錄因子),每組檢測時各做3個復孔。轉錄因子質粒構建需視難易程度另行收費。

 

客戶需提供信息:

①目標啟動子及轉錄因子相關信息(名稱、種屬、基因序列等)

提供給客戶:

①質粒及其構建報告

②原始數據

③雙熒光素酶檢測報告

報價情況

美侖生物7000元/組+轉錄因子過表達載體合成費用(1000元+議價);

服務周期3-5周

二.  miRNA靶基因驗證 (針對3’UTR元件)

  miRNA主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用(降解或抑制翻譯),將目的基因3’UTR(野生型和結合位點突變型)序列構建至載體中報告基因F-Luc的3’端,通過比較過表達miRNA后,報告基因表達的改變(螢光素酶的活性下降還是不變),來確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點。

目的:驗證miRNA與靶基因3’UTR 是否發生調控作用。

材料:質粒pMIR-REPORT Luciferase基因3'UTR(Wt);pMIR-REPORT Luciferase-基因3'UTR(Mut);pRL-CMV(H321,Promega);293T細胞株

步驟:

1) 靶點預測及確認后,直接合成靶基因3’UTR序列或microRNA在靶基因3’UTR上的結合位點序列;

2) 將上述合成的DNA片段克隆至報告基因載體psiCHECK2 (C8021) or pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector (E1330);

3) 購買microRNA mimics;

4) 將報告載體與microRNA mimics共轉染293T細胞;

5) 多功能酶標儀檢測報告基因表達水平

6) 數據分析,整理提交客戶原始數據及實驗報告

注:為了實驗嚴謹性,可加入靶基因3’UTR區microRNA預測結合區域的突變體作為對照,進一步說明問題。

客戶需提供信息:

①靶基因名稱

②靶基因種屬

③調控因子相關信息

提供給客戶:

①質粒及其構建報告

②原始數據

③雙熒光素酶檢測報告

技術路線簡圖

 

 

 

報價情況

美侖生物5500元/組(靶點)

服務周期3-5周

如何委托:

如果您需要委托我們開展相關服務,請直接聯系我司0411-39217210或當地授權代理商,

并需要填寫項目委托書,發至郵箱[email protected]

雙螢光素酶報告基因檢測服務委托單 下載

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